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實(shí)驗(yàn)概要
從土壤微生物中提取總DNA并純化,高質(zhì)量的DNA可用于后續(xù)文庫構(gòu)建。
主要試劑
TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)
PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)
DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)
蛋白酶K(25 mg/mL)
溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)
20% SDS
氯仿
異戊醇
異丙醇
70%乙醇
RNAse 20 mg/mL
QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒(Qiagen)
主要設(shè)備
50mL、1.5 mL離心管
搖床
高速離心機(jī)
水浴鍋
電泳槽
電泳儀
MixMax漩渦振蕩器
實(shí)驗(yàn)材料
土壤樣品
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 總DNA提取:
(1) 取2 g土樣,置于50mL滅菌的離心管中;
(2) 加入10 mL TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)懸浮土樣,200轉(zhuǎn)搖床振蕩10min充分混勻;
(3) 10 000 r/min離心5 min,棄上清,重復(fù)洗滌多次至上清基本為無色;
(4) 用5 mL PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)漂洗一次;
(5) 沉淀加入13.5 mL DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0),混勻后加入100 μL蛋白酶K(25 mg/mL)和200 μL溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0),37℃水浴30 min,每隔10 min顛倒混勻;
(6) 加入2 mL 20% SDS,65℃水浴2 h,每隔20 min顛倒混勻;
(7) 8 000 r/min室溫離心15 min,取上清,用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次;
(8) 水相中加入0.6倍體積的異丙醇,4℃沉淀一夜;
(9) 11 000 r/min 4℃離心20 min收集DNA沉淀;
(10) 70%乙醇漂洗兩次,干燥后用100 μL ddH2O(含RNAse 20 mg/mL)溶解,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管。
2. 總DNA純化:
(1) 配制0.8%瓊脂糖凝膠;
(2) 每個(gè)上樣孔加入50 μL粗DNA,進(jìn)行低電壓長時(shí)間電泳(4℃, 25 V, 8 h);
(3) 電泳結(jié)束后,切下主帶所在的凝膠(膠的體積盡可能?。?/p>
QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒(Qiagen)回收:加入3倍體積的Buffer QXⅠ及適量的QIAXⅡ(Glassmilk),55℃溫浴10 min,每隔2 min輕輕用手指彈起沉淀(回收大片段時(shí)不要渦旋),待凝膠*溶解,12 000 g離心1 min,棄上清;再加入500 μL Buffer QXⅠ洗滌沉淀1次以消除剩余凝膠;再用500 μL Buffer PE洗滌沉淀2次,將沉淀晾干,加入適當(dāng)體積的ddH2O,離心后收集上清,瓊脂糖凝膠電泳確定回收效率。