紅外線滅菌器是人類染色體標(biāo)本的制備好幫手
更新時(shí)間:2012-11-26 點(diǎn)擊次數(shù):5277次
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />
掌握人類外周血細(xì)胞培養(yǎng)方法及染色體標(biāo)本的制備方法。觀察人類染色體的形態(tài)和數(shù)目。
二、實(shí)驗(yàn)原理
血液中的T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)中經(jīng)一定劑量的植物血凝素(PHA)刺激,可以返幼進(jìn)行細(xì)胞分裂,用秋水仙素積累分裂相,用0.075mol/L-1KCI進(jìn)行低滲后,經(jīng)固定、染色,可見到分散的染色體。
三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
超凈工作臺(tái)、紅外線滅菌器(艾本森儀器公司)、無菌注射器(1ml、2ml、5m1)、針頭、培養(yǎng)瓶、橡皮塞、75%酒精棉球、離心機(jī)、定時(shí)鐘、試管架、量筒、刻度離心管、冰涼玻片,毛細(xì)滴管、恒溫水浴鍋、RPMI1640、小牛血清、肝素、秋水仙素、植物血凝素(PHA)、固定液(甲醇:冰乙酸為3∶1,現(xiàn)用現(xiàn)配)、0.075mol。L-1KCI低滲液、Giemsa染液、pH6.8磷酸緩沖液、恒溫培養(yǎng)箱、吹風(fēng)機(jī)、粗天平、5%NaHCO3、顯微鏡。
四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟
(一)接種
取500單位/lml的肝素0。2ml濕潤針筒后,取靜脈血1~2ml,轉(zhuǎn)動(dòng)針筒以混勻肝素;隨后立即插入滅菌小瓶內(nèi),送入超凈工作臺(tái)(消毒、滅菌等略),在紅外線滅菌器旁將血液滴入2~3個(gè)盛有5ml培養(yǎng)液(4mlRPMIl640、lml小牛血清,5mgPHA,用5%的NaHCO3調(diào)pH至7.0~7.4)的培養(yǎng)瓶內(nèi),每瓶0.2~0.3ml(7號(hào)針頭13滴),蓋上橡皮塞,輕輕搖動(dòng)以混勻。
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1.將培養(yǎng)瓶放在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h。
2.在終止培養(yǎng)前2~4h,將0.01%的秋水仙素1~2滴(7號(hào)針頭)加入培養(yǎng)瓶內(nèi),輕輕搖勻.放回溫箱內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)2~4h。
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1.用吸管充分吹打瓶壁,吸取培養(yǎng)物移入刻度離心管內(nèi),相對(duì)離心管平衡后放入離心機(jī),離心8min(1000轉(zhuǎn)/分),吸去上清液,留下沉淀物。
2.低滲處理:加8ml預(yù)溫(370C)的0.075mol。L-1KCI低滲液,用吸管打勻使細(xì)胞懸
浮于低滲液中,放回37℃恒溫水浴鍋中,靜置15~20min,使白細(xì)胞膨脹,染色體分散、
紅細(xì)胞解體。
3.預(yù)固定:加入固定液1~2ml打勻。
4.再離心:1000轉(zhuǎn)/分離心8min,吸去上清液,留下沉淀物。
5.固定:沿離心管壁加入新配固定液8ml打勻,固定30min。
6.再離心:1000轉(zhuǎn)/分離心8min,棄去上清液,留下沉淀物。
7.再固定:再加入新配固定液8ml,打勻,靜置30min。
8.再離心:1000轉(zhuǎn)/分離心8min,棄去上清液。
9.第四次固定:加入新配固定液0.5~lml打勻成細(xì)胞懸液。
10.制片:用滴管吸細(xì)胞懸液2~3滴,滴在冰水預(yù)浸泡的潔凈載玻片上,立即用口吹散,在酒精燈上過幾次,吹風(fēng)機(jī)吹干或氣干。
11.染色:Giemsa染液(原液∶pH6.8磷酸緩沖液為1∶9)染色10min~20min、自來水沖洗、晾干。
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低倍鏡下找到分散良好的分裂相后,換高倍鏡、油鏡、認(rèn)真觀察。
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1.PHA是體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵問題,因此,要考慮它的質(zhì)量和濃度。鹽水提取物一般冰凍保存的時(shí)間不宜過長,時(shí)間長了效價(jià)減低。
2.濃度一般用1%~2%,每毫升培養(yǎng)液加0.2~0.4ml;濃度過高可能會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集。
3.秋水仙素溶液濃度和處理時(shí)間。一般zui終濃度每毫升培養(yǎng)液0.1~0.2μg為宜,作用時(shí)間為3~5h,一般秋水仙素溶液的濃度與處理時(shí)間有一定的關(guān)系。如果處理時(shí)間太短,則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞就少,相反,如果處理時(shí)間太長,則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞雖多,但其染色體縮得太短,以致形態(tài)特征模糊。
4.培養(yǎng)溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在37℃+0.5℃。
5.雙蒸水必須用玻璃蒸餾器制備,pH應(yīng)在6~7之間。
6.低滲步驟極為重要,關(guān)系到染色體分散的好壞,因此,低滲液濃度與低滲的時(shí)間應(yīng)掌握適當(dāng)。
7.離心機(jī)用水平式的,速度不宜過快。速度太快細(xì)胞團(tuán)不易打散,反之分裂相易丟失;固定液應(yīng)在臨用時(shí)新鮮配制,固定一定要*、均勻。若打散不夠,則細(xì)胞在玻片上易集結(jié)。
8.若吹打時(shí)用力過猛,細(xì)胞易破碎,以致染色體數(shù)目不完整;培養(yǎng)液的pH值應(yīng)掌握在7.4土0.1左右,pH值偏酸發(fā)育不良,偏堿時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)輕度固縮。
9.玻璃器皿都要十分干凈、無酸,所用試劑以分析純?yōu)楹谩?br />
10.操作過程應(yīng)保持高度無菌概念,嚴(yán)防細(xì)菌和病毒污染;在外周血培養(yǎng)中,PHA對(duì)淋巴細(xì)胞的作用,個(gè)體差異較大。同樣方法和條件,分裂相多少及分散情況不一樣。因此,若失敗,應(yīng)充分考慮到這些因素。
?。ㄎ澹╊A(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
將制作好的片子在油鏡下仔細(xì)觀察,選擇較好的分裂相進(jìn)行照相、剪貼、分組,將照片上的核型進(jìn)行剪貼,寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告與實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
染色體數(shù)目為46XX,(XY)為人類正常核型。若某對(duì)染色體少了一條(2n-1),細(xì)胞染色體數(shù)目為45;或某一對(duì)染色體多了一條(2n+1),細(xì)胞染色體數(shù)目為47;若為兩種核型,46,XX/46,XXY稱為嵌合體。以上三種為異常核型。
艾本森的生產(chǎn)的紅外線滅菌器已經(jīng)在各個(gè)實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用,為各個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功提供了有力的保障。請(qǐng)大家認(rèn)準(zhǔn)ABSON品牌的紅外線滅菌器。