銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)是臨床常見的條件致病菌,由于其固有和獲得性耐藥,使臨床治療成為一大難題。CARB基因編碼產(chǎn)生羧芐西林酶,為β-內(nèi)酰胺酶Bush分類中的2c,在我國CARB基因、流行基因亞型的研究未見報道。我們研究分析了2005年1~12月臨床分離的34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌(IMPRPa),發(fā)現(xiàn)了我院IMPRPa攜帶CARB-3基因,現(xiàn)總結報告如下。
1 材料與方法
1.1 菌株來源與質(zhì)控菌株 34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌來自于2005年1~12月我院住院病人的臨床分離標本(包括:痰液、尿液、傷口分泌物、膿液、血液等),質(zhì)控菌株包括:銅綠假單胞菌ATCC27853,大腸埃希菌ATCC25922。
1.2 菌株鑒定及亞胺培南耐藥菌株篩選 試驗菌株經(jīng)BD Phoenix100全自動微生物分析儀鑒定到種,采用該儀器配套藥敏試驗復合板篩選亞胺培南耐藥的Pa。
1.3 主要儀器設備與試劑 Eppendorf centrifuge 5417R 低溫離心機,HtPot40干式恒溫金屬浴(合肥艾本森),Bio-RAD電泳儀,Bio-RAD 凝膠成像系統(tǒng), 瓊脂糖(OXOID),100bp DNA Ladder Marker(大連寶森),6×Loading buffer(北京天為時代)。
1.4 模板DNA提取 采用蛋白酶K消化法。
1.5 基因擴增 引物序列為:P1:5′-AAA GCA GAT CTT GTG ACC TATTC -3′,P2: 5′-TCA GCG CGA CTG TGA TGT ATA AAC -3′,擴增產(chǎn)物為588bp。熱循環(huán)參數(shù)為:93℃預變性3min,93℃ 60s,55℃ 60s,72℃ 60s,zui后一個72℃ 延伸5min,共循環(huán)35周期。純水為陰性對照。耐藥基因檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。
1.6 結果判斷 取10μl擴增產(chǎn)物與2μl 6×上樣緩沖液混勻,點樣于1.5%瓊脂糖凝膠,在100V電壓電泳30min,出現(xiàn)588bp的條帶即為CARB基因陽性。用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。
1.7 序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物工程公司進行DNA序列分析,測得序列在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 中的BLASTn程序進行同源性和基因亞型分析。
2 結果
2.1 CARB基因PCR檢測結果 34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌共檢出11株CARB基因陽性株,檢出率為32.4%,PCR擴增結果見圖1。
2.2 序列分析結果 任意抽取5株CARB基因陽性的PCR擴增產(chǎn)物進行單向測序,測得序列與GenBank中注冊號為DQ309773的CARB-3基因*同源(Identities=100%)。因此我院流行的CARB基因亞型為CARB-3型。
圖1 部分Pa菌株CARB基因PCR產(chǎn)物電泳圖?。裕?/div>
3 討論
CARB基因zui早于1981年在Pa中發(fā)現(xiàn)[1],近年又從不動桿菌、弧菌屬、奇異變形桿菌中檢出,已發(fā)現(xiàn)CARB1-9型9個亞型[2~4]。我院IMPRPa的CARB基因攜帶率為32.4%,提示醫(yī)務工作者應重視和加強Pa的防治和耐藥監(jiān)測。對CARB基因陽性菌株進行DNA序列分析,經(jīng)同源性比較,結果顯示:我院流行的CARB基因亞型為CARB-3型。IMPRPa中CARB基因檢出、CARB-3基因亞型發(fā)現(xiàn)為國內(nèi)報道。
銅綠假單胞菌是臨床常見的條件致病菌,正常情況下不感染人體任何組織,但當人體免疫力下降或嚴重創(chuàng)傷或醫(yī)療操作后,Pa幾乎可以感染人體的任何組織,臨床可表現(xiàn)為局部化膿性炎癥和全身性感染,常常危及患者生命。碳青霉烯類抗生素(如亞胺培南)因其*的抗菌優(yōu)勢,被臨床廣泛用于Pa引起的重癥感染,導致臨床分離株對亞胺培南耐藥性增加。
Pa對亞胺培南耐藥的機制主要有膜孔蛋白缺失、外排泵和產(chǎn)酶等三種機制[5]。我們對IMPRPa的耐藥機制的相關研究正在進行中。
作者:顏英俊 糜祖煌 劉華 楊洋 張凱 楊明清 黃文方 中華醫(yī)學研究雜志
【參考文獻】
1 Paul G,Joly G ML,Bergogne BE,et al.Novel carbenicillin-lydrolyzing β-lactamases(CARB-5)from Acinetobacter calcoaceticus var.anitratus.FEMS Microbiol Lett,1989,50(1-2):45.
2 Alejandro P,Roberto G M,Hector AS,et al.CARB-9 a carbenicillinase encoded in the VCR region of Vibrio cholerae Non-O1,Non-O139belongs to a family of cassette-encoded β-lactamases.Antimicrob Agents Chemother,2004,48(10):4042.
3 Nucleotide sequence of the blaRTG-29CARB-5) gene and phylogeny of a new group of carbenicillinases.Antimicrob Agents Chemother,2000,44(4):1070.
4 Bert F,Branger C,Lambert-zechovsky N.Comparative activity of beta-lactam agents (carbapenem excepted)against Pseudomonas aeruginosastrains with CARB or OXA beta-lactamASES.Chemotherapy,2004,50(1):31.
5 Okamoto K,Gotoh N,Nishino T.Pseudomonas aeruginosa reveals high intrinsic resistance to penem antibiotics:penem resistance mechanisms and their interplay.Antimicrob Agents Chemother,2001,45(7):1964.
作者單位:1 610072 四川成都,四川省醫(yī)學科學院、四川省人民醫(yī)院檢驗科2 214026 江蘇無錫,無錫市克隆遺傳技術研究所